LA DETERMINATION DES GROUPES SANGUINS ABO-RHESUS

INTRODUCTION 

Les tests de compatibilité pré-transfusionnels, notamment le groupage sanguin ABORH, sont indispensables pour prévenir la transfusion des produits sanguins incompatibles susceptibles de provoquer des réactions hémolytiques [1]. Le groupage sanguin peut être effectué par la technique manuelle ou automatisée. Chacune de ces méthodes présente ses avantages et ses inconvénients. La technique manuelle, la plus couramment utilisée et toujours considérée comme référence, présente des limites inhérentes aux anticorps de faible affinité, à la variabilité du ratio cellules / sérum, et la variabilité de l’interprétation inter-observateurs [2, 3]. Ces analyses nécessitent beaucoup de travail et les résultats dépendent de l’opérateur [1]. L’introduction des techniques plus récentes, semi-automatisées ou entièrement automatisées ont permis de remédier à ces limites [2, 3, 4]. L’automatisation des banques de sang introduite dans les pays développés dans les années 1960 [5] offre l’avantage d’améliorer la qualité des tests en améliorant l’objectivité et la reproductibilité, en diminuant le nombre d’erreurs humaines, réduisant le temps d’exécution des tests et ainsi le risque des réactions transfusionnelles dues à une transfusion sanguine inadéquate [6, 7]. Elle facilite aussi la documentation, la traçabilité et l’archivage des résultats [2]. Pour ces raisons, l’automatisation des banques de sang est en train d’être adoptée par de plus en plus de centres et devient rapidement une technologie standard [8, 9]. Cependant, il existe une possibilité d’erreurs humaines en raison des étapes manuelles impliquées, notamment l’étiquetage des échantillons, l’introduction des réactifs et la saisieinterprétation des résultats [2]. L’imprécision étant toujours présente, l’optimisation des systèmes automatisés implique une formation spécifique du personnel et le strict respect des procédures opératoires standard [10]. Le Centre National de Transfusion Sanguine (CNTS) de Dakar, au vu de sa charge de travail élevée, a fait l’acquisition d’un système entièrement automatisé : Qwalys-3. Il s’agit d’un automate complet d’immuno-hématologie utilisant une technique de magnétisation des hématies «Erythrocytes Magnetized Technology», une nanotechnologie innovante, développée par DIAGAST (Loos, France) [43]. La technique manuelle y est encore pratiquée afin de palier à un arrêt de l’automate, le personnel est, de ce fait, formé à l’utilisation des deux méthodes. 2 Avant utilisation, l’automate doit subir une validation appropriée des résultats, pour tester sa compétence et démontrer la maitrise des processus exécutés par le système [11]. C’est dans le cadre de ce processus de validation préalable que nous nous sommes proposés de réaliser cette étude dont le but était d’évaluer les performances de cet appareil (Qwalys-3) en comparant ses résultats de groupage sanguin des systèmes ABO-RH et la recherche de l’antigène D faible à ceux de la méthode manuelle. De manière spécifique, nous allons : – Comparer les résultats de l’automate à ceux de la méthode manuelle – Dégager d’éventuelles discordances et proposer des solutions Pour atteindre ces objectifs, notre travail s’articulera autour de deux parties. – Une première partie qui traitera des généralités sur les systèmes de groupes sanguins avec un focus sur les systèmes ABO et RH. – Une seconde partie qui sera consacrée à la présentation de notre méthodologie, de nos résultats et enfin au commentaire de ces résultats. 

LE GROUPE SANGUIN

 Le groupe sanguin est défini comme un ensemble des antigènes allotypiques, génétiquement transmis et détectés par des anticorps à la surface de la membrane des globules rouges [12]. Il permet de classer les individus, afin de permettre des transfusions dans les conditions optimales de compatibilité. Différentes cellules sanguines portent des antigènes. Il y a donc des groupes sanguins érythrocytaires et des groupes sanguins leuco-plaquettaires. Les globules rouges peuvent porter plusieurs sortes d’Ag déterminant les groupes érythrocytaires. Les plus importants en pratique clinique sont les systèmes ABO et RH en suite viennent le système Kell, le système Duffy et le système Kidd.

Historique 

Les groupes sanguins ABO ont été découverts en 1900 par Karl Landsteiner [14]. Il observa que le sérum de certains sujets agglutinait les hématies d’autres sujets et a ainsi identifié 2 antigènes qu’il a appelés A et B. Les hématies non agglutinées par les deux anticorps correspondants sont appelées O (zéro). Ses élèves De Castello et Sturli ont décrit en 1902 le phénotype AB. Von Dungern et Hirszfeld, ont démontré que les caractères A et B étaient contrôlés génétiquement et en 1924 Bernstein a prouvé la transmission mendélienne des allèles de ce système. En 1939 Levine et Stéton constataient la présence chez une parturiente, d’un allo-anticorps agglutinant les hématies de l’enfant et du père mais aussi celles de 85% des échantillons d’individus de race blanche de la région de New York. L’appellation d’antigène Rhésus lui a été donné à la suite des travaux de Landsteiner et Wiener, qui en injectant des hématies de singe « Macaccus Rhésus » à un lapin, ont obtenu un hétéro-anticorps agglutinant les hématies de singe et aussi 85% des échantillons d’individus de race blanche de la région de New York. De nos jours, suite à de multiples travaux, on enregistre plus de 30 systèmes de groupes sanguins qui participent au polymorphisme humain parmi lesquels on peut citer dans l’ordre chronologique : les systèmes MNSs (1927) ; P (1927) ; Rh (1939-1940) ; Lutheran (1945) ; Kell (1946) ; Lewis (1946) ; Duffy (1950) ; Kidd (1951) etc. [15].Cependant, il est actuellement décrit la présence de plus de 300 Ag érythrocytaires sur la membrane des GR 

Système ABO 

Le système ABO est le système majeur de l’immunologie transfusionnelle. De par sa répartition tissulaire, il joue également un rôle fondamental dans l’immunologie de greffe. Il est le mieux connu et le plus important de tous les systèmes des groupes sanguins sur le plan clinique. Les phénotypes ABO sont définis à la fois par l’antigène globulaire et l’anticorps plasmatique

 Antigènes du système ABO 

Deux antigènes peuvent être reconnus à la surface de l’hématie : l’antigène A et l’antigène B. Ces deux antigènes permettent de définir quatre groupes sanguins : groupe A, si l’antigène A est le seul présent sur les hématies du sujet ; groupe B, si l’antigène B est le seul présent ; groupe AB, si les antigènes A et B sont tous les deux présents ; le groupe O, si aucun des antigènes A ou B n’est présent (Tableau I) [17]. Tableau I : Fréquence des Ag du système ABO chez les caucasiens et sujets de race noire [18] Fréquence phénotypique Antigène Génotype Phénotype (groupe) Race noire Caucasiens (Sénégal) (France) 

Variants A1 et A2 L’antigène

 A est double et l’anticorps anti-A est mixte. En effet, il est possible de démontrer par des expériences d’adsorption sélective que le sérum anti-A (des sujets B) contient en fait deux anticorps : un anticorps anti-A qui réagit avec toutes les hématies de groupe A et un autre anticorps qui ne réagit qu’avec 80% d’entre elles, qui sont alors appelées A1. Les globules rouges non agglutinés par ce second anticorps (anti-A1), sont appelés A2 (20% des sujets A) [19]. Cette distinction permet de définir six phénotypes : A1, A2, B, A1B, A2B, O . 

Les anticorps du système ABO 

Les anticorps anti-A et anti-B sont régulièrement présents chez tous les individus dépourvus de l’antigène correspondant. Ils sont classiquement dénommés « naturels et réguliers ». Ils sont produits lors de la petite enfance, en réponse à des stimulations immunologiques environnementales et aux antigènes A ou B exprimés par les bactéries de la flore intestinale. Des anticorps « immuns » anti-A ou anti-B peuvent également apparaître à la suite de stimulations supplémentaires. Les anticorps naturels et immuns ont des caractéristiques physiques différentes qui permettent de les distinguer (Tableau II) [17]. Tableau II: Les anticorps du système ABO [17] Groupes Antigènes globulaires Anticorps plasmatiques A A Anti-B B B Anti-A AB A et B Aucun O ni A, ni B Anti-A et Anti-B  Anticorps anti-A, anti-B et anti-A et B «naturels» Ce sont les anticorps réguliers anti-A des sujets B, anti-B des sujets A, et anti-A et anti-B des sujets O. Leur production est liée à la réponse primaire de l’organisme dirigée contre des antigènes A ou B portés par les bactéries saprophytes de la flore intestinale ou diverses substances de l’environnement. Ils apparaissent généralement entre le 3è et 6è mois de vie, et leur concentration atteint un maximum vers l’âge de 10 ans. Certains anticorps sont de type irrégulier : ce sont par exemple l’anti-A1, des sujets A2, A2B ou A faibles et l’anti-H des sujets A1 et A1B. Ces anticorps naturels ont les propriétés suivantes : – Ils sont spontanément agglutinants en milieu salin ; – Leur optimum thermique est à +4 °C ; – Ils peuvent être neutralisés par des substances de groupes A ou B solubles ; – Ils n’ont pas de pouvoir hémolysant direct; – Ils sont thermolabiles (10min à +70°C) ; – Ils sont composés essentiellement d’Ig M (d’où ils ne traversent pas la barrière placentaire). La concentration des anticorps anti-A ou anti-B est diminuée dans certaines pathologies et augmentée dans certaines anémies hémolytiques auto-immunes, les cirrhoses éthyliques, ou certaines hépatites chroniques actives [17, 20]. 7  Anticorps anti-A et anti-B immuns Ils peuvent résulter d’une allo-immunisation par grossesse ou exceptionnellement d’une transfusion incompatible. Ils apparaissent entre le cinquième (5ème) et le dixième (10ème) jour après stimulation et persistent quelques semaines à quelques mois après immunisation. Ces anticorps immuns sont inconstants et ont les propriétés suivantes : – Ils ne sont pas spontanément agglutinants en milieu salin ; – Leur activité est conservée à +37°C (optimum thermique); – Ils sont difficilement neutralisables par des substances solubles ; – Ils sont hémolysants ; – Ils résistent au traitement par la chaleur (10min à +70°C) ; – Ils sont constitués essentiellement d’Ig G. Ces anticorps immuns, à la différence des précédents, sont capables de franchir la barrière placentaire et peuvent donc être impliqués dans des problèmes d’immunisation fœto-maternelle [17]. Ils sont aussi susceptibles d’entrainer des accidents hémolytiques sévères en induisant la destruction des hématies du receveur lorsqu’ils sont présents dans le plasma des donneurs. Le sang de tels donneurs doit être exclusivement réservé aux malades de même groupe ABO 

 Génétique du système ABO 

Les antigènes du système ABO sont transmis héréditairement et les gènes ou allèles qui les conditionnent sont portés par la neuvième paire de chromosomes et sont au nombre de trois : A, B, O. A et B sont des allèles qui s’excluent lors de la méiose, et sont co-dominants entre eux [17, 21]. A partir des six phénotypes précédemment décrits on peut inférer de l’existence de dix génotypes (Tableau III). Tableau III: Phénotypes et génotypes du système ABO [17]. Phénotypes Génotypes possibles correspondants Il n’est pas possible, pour les groupes A1, A2 et B, de désigner le génotype à partir du phénotype par les méthodes habituelles de groupage. Ce problème peut être résolu par l’étude des phénotypes des parents et ceux des grands parents si nécessaires. Les phénotypes O, A1B et A2B expriment quant à eux le génotype lui-même du sujet considéré : le sujet de groupe O est bien entendu homozygote OO et les sujets de groupe A1B ou A2B sont hétérozygotes [17]. 

Système Rhésus 

Il se classe parmi les systèmes immunogènes et c’est l’un des plus importants systèmes de groupes sanguins après le système ABO. C’est le plus polymorphe de tous les systèmes de groupes sanguins érythrocytaires connus chez l’homme . Il est d’un intérêt considérable en transfusion sanguine et en obstétrique. Certains accidents transfusionnels comme la maladie hémolytique du nouveau-né par incompatibilité fœto-maternelle et les anémies hémolytiques, peuvent être dus aux conflits immunologiques provoqués par les antigènes rhésus.

 Les antigènes du système Rhésus

 Le système rhésus se définit par sa complexité par rapport à tous les systèmes de groupes sanguins. A ce jour, près de 50 antigènes du système rhésus ont été décrits dont cinq principaux méritent d’être connus (surtout en pratique transfusionnelle) :  L’antigène D (RH1) C’est le plus immunogène des antigènes des groupes sanguins érythrocytaires. L’antigène D est bien développé à la naissance et est strictement limité aux érythrocytes. Les sujets qui possèdent l’Ag D sont dits de rhésus positifs(+) et ceux qui ne le possèdent pas sont dits de rhésus négatifs (-). Cet antigène a un fort pouvoir immunisant lors qu’il est introduit dans un organisme qui ne le possède pas. Il est donc responsable de la majorité des accidents d’allo immunisations transfusionnelles ou fœto-maternelles (cas où l’antigénocompatibilité D n’a pas été observée). Sa détermination le rend indissociable du groupage sanguin ABO. En Afrique, l’antigène D est présent chez 90 à 100 % des individus et 0 à 10 % sont de rhésus négatif, c’est-à-dire ils n’ont pas l’Ag D [25]. 9  Les autres quatre antigènes sont les suivants : -C (RH2) défini par l’anti-RH2 -E (RH3) défini par l’anti-RH3 -c (RH4) défini par l’anti-RH4 -e (RH5) défini par l’anti-RH5 Les antigènes C et c, d’une part, et les antigènes E et e d’autre part, sont antithétiques, ce qui signifie que si l’un est absent, l’autre est forcément présent [24]. Ainsi, on trouve des individus C+ c – ; C– c+ etC+ c+, mais jamais des individus C– c-.De même avec le couple (E, e) tout individu E- est nécessairement e+. L’antigène C est présent chez 70 % des sujets de race blanche, E chez 30 %, c chez 80 %, e chez 98 % [19]. Les structures porteuses de l’activité antigénique rhésus sont des polypeptides

 Variants de l’antigène Rhésus

 Les variants antigéniques du système rhésus sont liés à son polymorphisme génétique. L’antigène D normal peut être considéré comme une mosaïque d’épitopes. Les tests d’agglutination directe ne permettent pas toujours de classer les hématies en rhésus positif ou négatif. Les hématies de certains sujets réagissent faiblement avec l’anti-D ou nécessitent un temps de réaction plus long que la plupart des hématies rhésus positif. Un nombre plus faible de sujets possède des hématies non agglutinées par l’anti-D, mais qui adsorbent l’anticorps. Ces hématies sensibilisées peuvent être agglutinées par l’antiglobuline. L’expression faible de l’antigène D appelé antérieurement Du, pour certains auteurs et les antigènes D partiels, constituent les principaux variants de ce système. Particulièrement, l’antigène Du doit être couramment déterminé dans la pratique chez les donneurs de sang. La détermination du phénotype rhésus se fait par une technique d’agglutination en utilisant des sérums tests. Le phénotypage rhésus doit être complété en effectuant la recherche du variant antigénique Du en cas de négativité et est confirmé par la technique de fixation-élution. 10 Figure 1: Structure de l’antigène D 

 Les anticorps du système Rhésus

 Contrairement aux allo-anticorps du système ABO, les allo-anticorps dirigés contre les antigènes du système rhésus sont toujours acquis soit lors des transfusions, soit lors de grossesses (le fœtus portant des antigènes d’origine paternelle et immunisant sa mère). Ces alloanticorps acquis, dits immuns, n’apparaissent qu’après stimulations antigéniques. Ils sont de nature Ig G. Les risques d’apparition des allo-immunisations imposent la compatibilité transfusionnelle chez les malades à risque (polytransfusés chroniques, jeune femme). La détermination du rhésus standard est donc nécessaire avant toute transfusion et chez les deux conjoints en examen prénuptial. Les allo-anticorps immuns du système rhésus sont impliqués également dans les réactions hémolytiques post-transfusionnelles et les maladies hémolytiques du nouveau-né (+++). Les autres antigènes E, c plus rarement C et e peuvent également provoquer l’apparition d’anticorps immuns responsables d’hémolyses post-transfusionnelles et de maladies hémolytiques du nouveau-né. L’allo-immunisation résultant des anticorps du système rhésus se produit avec une fréquence décroissante selon leur immunogénicité D > E > c > e > C [9]. Le plus souvent les anticorps anti-rhésus apparaissent seulement lors de la seconde grossesse dans le cas particulier de l’allo-immunisation fœto-maternelle. 11 Certains de ces anticorps peuvent être classés Ig M (anti-RH3) ou retrouvés chez certains patients n’ayant jamais été exposés à une stimulation inter-humaine [24]. En dehors du système ABO et Rhésus, les systèmes Kell, Duffy, Kidd, et MNS doivent aussi être connus car certains de leurs antigènes sont fortement immunogènes.

Génétique du système Rhésus

Les deux protéines RhD et RhCE sont codées par deux gènes homologues, RHD et RHCE. Le locus rhésus est localisé sur le chromosome 1 en position 1q34q36 et sa structure n’est pas identique chez les sujets de rhésus positif et négatif. En effet, chez les sujets de rhésus positif, il existe deux gènes (deux structures de gènes RH D et RH CE) homologues en tandem (D et C c E e) sur le chromosome 1, alors qu’il n’en existe qu’un seul (C c E e) chez les sujets de rhésus négatif [22, 27]. En fonction des formes alléliques, on distingue huit haplotypes qui sont notés DCe, DcE, dce, Dce, dCe, dcE, DCE et dCE où d représente l’absence de RHD. L’étude moléculaire, après clonage des gènes, démontre que le gène D synthétise l’antigène D et le gène C c E e synthétise les protéines C c et Ee. La fréquence des haplotypes est variable en fonction des populations. L’haplotype porteur de la délétion d est relativement fréquent en Europe de l’Ouest et très rare en Extrême-Orient. Dans les populations originaires d’Afrique subsaharienne, c’est l’haplotype Dce qui est le plus répandu [12].Selon le concept génétique actuel du système rhésus, la transmission héréditaire des antigènes rhésus ne peut s’expliquer ni sur le modèle d’un gène unique ni sur celui d’un modèle à trois gènes comme cela a été proposé depuis fort longtemps, mais plutôt par le modèle à deux gènes [28]. La notion d’haplotype selon laquelle les gènes sont transmis en bloc de génération en génération a été conservée, donc l’expression des antigènes du système rhésus est contrôlée par les deux gènes ; le gène D et le gène CE.