Le modèle L-Tym/D-Apta

Electrochemical Aptamer-Based Binding Assay for Trace Detection of Chiral Compounds »

Principe de la méthode

 Dans ce travail, la présence d’une cible chirale en solution est détectée par électrochimie. En présence de son aptamère, un équilibre s’établi entre la forme libre et liée de la cible. Du fait de la grande dimension de l’aptamère devant celle de la cible, le complexe ligand/récepteur diffusera moins vite que le ligand seul (Fig 30). Ainsi, les courant mesurés dependront des quantités de cible libres et liées. Fig 30 : Principe général de détection homogène d’une reconnaissance Aptamère/Cible par électrochimie Cette stratégie a l’avantage de reposer sur un principe de détection indépendant d’une reconfiguration de l’aptamère lors de la reconnaissance moléculaire.

Choix de la cible 

Pour valider ce principe de détection, l’aptamère sélectionné contre la L-Tyrosinamide (L-Tym, fig 32.a) a été utilisé car ce système a deux avantages. Le premier est une affinité de l’ordre du µM118, 119 qui permet déjà d’envisager une moindre consommation en réactif, et le second est que l’aptamère en série (D) présente une très bonne énantiosélectivité118 . Les conditions de reconnaissance optimales ont été déterminées en tampon tris 5 mM à pH 7,4, NaCl à 50 mM et MgCl2 à 10 mM. C’est avec ce tampon que toutes les expériences ont été réalisées. La séquence de 49 nucléotides anti-LTym sera désignée D-Apta49 (5’-AATTCGCTAGCTGGAGCTTGGATTGA TGTGGTGTGTGAGTGCGGTGCCC3’). Le protocole de titrage des solutions d’aptamère est détaillé dans la partie matériels et méthode (cf. p108). Tous les voltammogrammes ont été réalisés avec une vitesse de balayage de 50 mV.s-1 . Chiral Target Mesure d’excès énantiomérique par électrochimie en utilisant l’énantiosélectivité des aptamères II-1- le modèle L-Tym/D-Apta49 Dans ce chapitre est exposée la mise au point d’un nouveau principe de détection électrochimique d’une reconnaissance chirale en phase homogène d’une cible par son aptamère. Ce travail a fait l’objet d’une publication dans Anal. Chem. en 2012 intitulée « Simple and Highly Enantioselective

Dispositif expérimental

 Les mesures électrochimiques ont été réalisées à l’aide de cellules électrochimiques miniaturisées à usage unique obtenues par sérigraphie au laboratoire. Ces cellules à trois électrodes réunissent sur une petite surface plane une pseudo-électrode de référence Ag/AgCl, une contre électrode et une électrode de travail de 0,07 cm2 en carbone (Fig 31). Ces électrodes sont successivement déposées à l’aide d’encre d’argent et de carbone et séchées à 120°C pendant 15 min (cf matériels et méthodes p109). L’encre de carbone est constituée d’un mélange de polymère et de fragments micrométriques de carbone qui réticulent durant le séchage. Au terme de cette fabrication, un espace de travail de 0,2 cm2 regroupant ces trois électrodes est délimité en utilisant une couche diélectrique hydrophobe. L’utilisation de ces électodes présente 3 avantages :  Le matériel est jetable, il n’y a donc pas besoin de régénérer l’électrode de travail par polissage;  Du fait de l’inclusion de carbone dans une matrice polymère, le courant capacitif mesuré est faible ;  La taille réduite de ce système à trois électrodes entouré d’une matrice hydrophobe restreint la surface occupée par le solvant ce qui permet de travailler dans des microvolumes ( 50 µl) et donc d’être peu consommateur en matériel biologique. d. Détection électrochimique de la L-Tyrosinamide L’électroactivité de la fonction phénol de la L-Tym (Fig 32.a) a été utilisée dans un premier temps pour le suivi de la reconnaissance.La figure 33.a présente le comportement électrochimique de la L-Tym en solution. L’oxydation du phénol débute vers E = 0.48 V vs Ag/AgCl selon un processus d’oxydation irréversible. Cette réaction produit des radicaux cations phénoxyls, qui en milieu aqueux se déprotonnent très rapidement pour donner des espèces extrêmement réactives pouvant dimériser, voire polymériser. Ce processus est généralement à l’origine d’une passivation de l’électrode, caractérisée ici par un décalage anodique du pic d’oxydation de la L-Tym et une diminution du courant en fonction du nombre de balayages successifs.