Les acteurs des chaînes respiratoires aérobies

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Quelques données sur l’évolution de ces processus

L’évolution des processus énergétiques suscite le débat depuis plusieurs décennies. En 1929, dans un article sur les origines de la vie, J. Haldane présente la fermentation comme le mécanisme primordial de transformation de l’énergie, et le décrit, tout comme Pasteur le fit auparavant, comme étant « la vie sans oxygène » (Haldane, 1929). Pendant longtemps l’idée que la fermentation était le processus ancestral, la première voie de transformation de l’énergie utilisée par les cellules, a été un pilier de l’hypothèse de la « primordial-soup » (soupe originelle). Cependant cette théorie sur l’origine de la vie a été depuis remise en question (Lane et al., 2010), tout comme le « modèle de la fermentation ».
Ce modèle repose principalement sur les données géochimiques montrant l’absence d’oxygène dans l’environnement primitif. Il apparaît cependant que les premiers proces-sus chimiosmotiques ne reposaient pas sur l’oxygène mais utilisaient du CO2, présent à cette époque dans l’atmosphère. La fermentation est un processus complexe qui requiert de nombreuses enzymes. Les grandes divergences existantes entre les enzymes des archées et celles des bactéries suggèrent que la fermentation n’est pas le mode de production d’énergie le plus ancestral, et que ce processus a évolué indépendamment dans ces deux règnes (Ducluzeau et al., 2013).
La découverte relativement récente de cheminées hydrothermales alcalines (Kelley et al., 2001) a permis l’émergence de nouvelles théories sur l’origine de la vie et de la bioénergétique. Ces cheminées créent des gradients de protons, qui auraient pu être uti-lisés pour eﬀectuer les premières synthèses de molécules organiques. La théorie chimios-motique aurait donc joué un rôle primordial dans l’apparition de la vie sur terre. Il existe de nombreuses théories divergentes sur l’origine de la bioénergétique (pour une revue voir Ducluzeau et al. (2013)), notamment sur les voies métaboliques utilisées par LUCA (Last Common Universal Ancestor) pour transformer l’énergie. Des nombreuses données (Lane et al., 2010) suggèrent que LUCA transformait l’énergie par couplage chimiosmotique, de ce fait, LUCA possédait une membrane diﬀérente de celles de archées et bactéries « mo-dernes », à travers laquelle un gradient de proton était établit. Il semblerait que LUCA poussait sur un milieu contenant H2/CO2, et utilisait le mécanisme chimiosmotique pour transformer l’énergie. Ce point de vue permet de comprendre pourquoi ce mécanisme et les enzymes qui mettent en place les gradients d’ions sont ubiquitaires et très conservées.
La respiration cellulaire basée sur la théorie chimiosmotique est apparue très proba-blement avant la photosynthèse, tout comme les processus de fermentation. Cependant, l’apparition de la photosynthèse a profondément influé sur l’évolution de la respiration et de la fermentation. En eﬀet, l’augmentation de l’oxygène atmosphérique a conféré un avantage sélectif aux organismes capables d’utiliser l’oxygène pour produire leur énergie et a ainsi favorisé la respiration aérobie. La fermentation de type « glycolyse » est apparu, permettant le catabolisme du glucose produit par la photosynthèse en acide lactique, éthanol ou CO2. La respiration cellulaire est beaucoup plus eﬃcace en terme de produc-tion d’ATP que la glycolyse. A part quelques exceptions, toutes les cellules utilisent les réactions oxydatives comme principale source d’énergie.

Les transferts d’électrons

Les mécanismes qui mettent en jeu un potentiel électrochimique transmembranaire nécessitent une translocation de protons à travers la membrane. Cette réaction est ender-gonique et thermodynamiquement défavorable, et doit être associée à une réaction exor-gonique : les transport d’électrons d’une espèce réductrice vers une espèce oxydatrice. Les électrons transitent dans des complexes protéiques membranaires par l’intermédiaire de groupes redox, au sein de ce qu’on appelle une chaîne de transfert d’électrons (CTE). Les CTE sont composées de complexe protéiques, la plupart transmembranaires, qui peuvent varier selon le type de chaîne ou d’organisme (cf. I.1.5).

Les réactions d’oxydo-réduction

Les CTE fonctionnent grâce à des séquences de réactions d’oxydo-réduction dans les-quelles les électrons sont transférés d’un couple redox à l’autre. Le nombre d’électrons transférés dépend du couple redox.
Par exemple, le cytochrome c eﬀectue une oxydo-réduction à 1 e−Fe3+.cyt c + 1 e− ⇋ Fe2+.cyt c
Alors que la ménaquinone eﬀectue une réduction à 2 e− couplée à une addition de 2 H+ MK + 2 e− + 2 H+ ⇋ MKH2
Le potentiel redox d’une espèce reflète la capacité de cette espèce à accepter ou à céder des électrons. Les électrons se déplacent vers les potentiels redox plus élevés.
La relation entre potentiel redox et △G La diﬀérence d’énergie libre de Gibbs △G disponible lors d’une réaction d’oxydo-réduction dépend de la diﬀérence de potentiel d’oxydo-réduction △Eh entre le couple donneur et accepteur. En général pour les couples redox A et B : △Eh = Eh(A) − Eh(B)
Il existe une relation directe entre la diﬀérence de potentiel redox de 2 couples △Eh, et la variation d’énergie libre de Gibbs △G accompagnant le transfert d’électron entre les 2 couples : △G = −nF △Eh
Avec n le nombre d’électrons transférés et F la constante de Faraday. A partir de cette équation, on peut déduire un équilibre pour △Eh = 0.
La stœchiométrie du transfert de proton dépend de l’énergie libre libérée par le transfert d’électrons, en tenant compte non pas des potentiels redox à l’équilibre Em mais des potentiels redox eﬀectifs qui prennent en compte les concentrations respectives des formes oxydes et réduites.

Transfert d’électrons

Les électrons passent d’un centre redox à l’autre par eﬀet tunnel (prédiction de méca-nique quantique) (Moser et al., 1992).
Trois facteurs principaux influencent le transfert :
1. La distance « bord à bord » entre le donneur et l’accepteur d’électron est un facteur important.
2. La diﬀérence de potentiel redox entre les 2 espèces.
3. La réaction du donneur ou de l’accepteur d’électrons (et leur environnement) aux variations de charges qui découlent du transfert d’électron.
Des distances supérieures à 14 Å entre groupes redox entraînent des vitesses de trans-fert d’électrons trop lentes pour des réactions enzymatiques (Page et al., 1999), par exemple une distance de 25 Å induit un temps de transfert supérieur à la seconde.
Il est intéressant de noter que pour les protéines possédant plusieurs groupes redox et dont la structure est connue, la distance entre deux groupes successifs est toujours inférieure à 14 Å dans la conformation sous laquelle se déroule le transfert (Page et al., 1999). Les variations de distance liées à des changements conformationnels sont un moyen de contrôler le transfert des électrons, comme dans les complexes Rieske/cytochrome b où la protéine de Rieske est mobile.
Si la distance est le facteur dominant dans les réactions de transfert d’électrons, le potentiel redox reste un facteur majeur. Le potentiel redox d’une espèce reflète la capacité de cette espèce à accepter ou à céder des électrons. Les réactions qui sembleraient défavorables au niveau du potentiel redox (« uphill ») peuvent être des points de contrôle.

Production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)

L’accepteur final d’électrons des chaînes respiratoire aérobie est l’oxygène, qui réagit très facilement avec des électrons isolés, comme ceux des semiquinones, et est convertie en anion superoxyde (O2− ). Cet ion peut être à l’origine d’une cascade de réactions redox non spécifiques, en générant des molécules hautement réactives comme l’eau oxygénée (H2O2) ou les radicaux hydroxyles (HO ) et hydropéroxyles (HOO ). Ces molécules sont regroupées dans la catégorie des dérivés réactifs de l’oxygène (« Reactive Oxygen Species » ou ROS en anglais) et sont toxiques pour les cellules. Les ROS interviennent dans de nombreux processus cellulaires et peuvent entraîner des mutations du génome, des réac-tions d’oxydation non spécifiques, elles peuvent également intervenir dans le vieillissement cellulaire (Raﬀaello et Rizzuto, 2011).
Des enzymes comme la superoxyde dismutase (SOD), la catalase et la péroxydase, permettent de convertir les ROS en des molécules moins dangereuses pour les composés cellulaires, mais leur mécanisme d’action est relativement lent, ces enzymes ne peuvent donc faire face à des productions massives de ROS.
Les principaux centres de production de ROS habituellement proposés sont les NADH: quinones oxydoréductases (Galkin et Brandt, 2005) (dont fait partie le complexe I de la chaîne mitochondriale) et les complexes Rieske/cytochrome b au niveau de leur site Qo (cf. I.1.5). Les ROS peuvent être produites suite à des court-circuits, des fuites, ou des réactions inverses, ce qui en plus de générer de la toxicité pour la cellule entraîne une perte d’eﬃcacité catalytique (Rutherford et al., 2012).
La cinétique de transfert des électrons est donc extrêmement importante, un électron qui ne sera pas transféré assez rapidement est susceptible de réagir avec l’oxygène. Le positionnement des cofacteurs et leurs potentiels redox sont déterminants pour éviter la production de ROS.

La théorie chimiosmotique

Lors de la découverte des complexes protéiques impliqués dans la respiration et la photosynthèse, le mécanisme utilisé pour la production de l’ATP était encore inconnu. On supposait ces protéines associées à la membrane, mais le rôle central de cette mem-brane dans la synthèse de l’ATP n’était pas encore à l’ordre du jour. En 1953, dans un article de Nature (Slater, 1953), Bill Slater développait la théorie de l’intermédiaire à haute énergie : le transfert d’électrons générerait un intermédiaire phosphorylé (∽P) qui permet la synthèse d’ATP. En 1961, deux auteurs proposaient deux théories alternatives, impliquant dans les deux cas les protons et la membrane.
– dans Williams (1961), R. Williams émettait l’hypothèse que le transport d’électron était couplé à l’injection de protons dans un milieu hydrophobe (par exemple la bicouche lipidique de la membrane). Le pH local étant très bas, il pourrait déplacer l’équilibre entre Pi, ADP et ATP en faveur de ce dernier.
– dans Mitchell (1961), P. Mitchell énonçait son hypothèse du « couplage de la phos-phorylation au transfert d’électrons et de protons par un mécanisme de type chi-miosmotique ».
D’après la théorie chimiosmotique, la membrane bioénergétique (membrane plasmique des procaryotes, membrane interne mitochondriale ou membrane du thylakoïde pour le chloroplaste) joue un rôle fondamental pour la synthèse d’ATP. Dans ces membranes on trouve deux types de pompes à protons : les pompes à protons associées à un transfert d’électrons et les pompes à protons associées à la synthèse d’ATP. La base de la théorie de P. Mitchell est que la première pompe génère un désequilibre de charges de part et d’autre de la membrane, dont le retour à l’équilibre est assuré par la seconde pompe, et permet la synthèse de l’ATP à partir d’ADP et de Pi. « L’intermédiaire de haute énergie » serait donc un gradient électrochimique de protons.
Il est possible de séparer le gradient électrochimique de proton △µH + en deux com-posantes :
– la diﬀérence de concentration en protons de part et d’autre de la membrane ∆pH
– la diﬀérence de potentiel électrique entre les 2 phases aqueuses séparées par la membrane, le potentiel membranaire ∆ψ △µH + = −F ∆ψ + 2.3RT ∆pH
△µH + peut s’exprimer en kJ.mol−1, cependant il est courant en bioénergétique d’uti-liser △µH + en unités de potentiel électrique, c’est-à-dire en millivolt, et de s’y référer comme étant la force protomotrice, ou pmf, exprimée par le symbole ∆p. Le composant majoritaire est souvent ∆ψ et le gradient de pH est autour de 0,5 unités (∼ 30 mV).
La théorie chimiosmotique de Mitchell comprenant des pompes à proton électrogé-niques et une ATP synthase translocatrice de protons est restée une hypothèse jusqu’à ce que des scientifiques travaillant sur la photosynthèse en aient démontré la validité. André Jagendorf fut le premier, en 1966, à valider cette hypothèse en utilisant des chloroplastes cassés et en les soumettant à un saut de pH induisant ainsi la synthèse d’ATP (Jagen-dor A, 1966).
Dans certaines bactéries utilisant la fermentation, le gradient électrochimique de pro-tons est remplacé par un gradient électrochimique de sodium (Na+), comme chez Propio-nigenium modestum, qui convertit le succinate en propionate et CO2.

Les acteurs des chaînes respiratoires aérobies

Il existe une grande diversité de chaînes bioénergétiques de transfert d’électrons, fonc-tionnant avec diﬀérents donneurs et accepteurs. Cependant, on observe un nombre limité d’enzymes et de repliements, témoignant d’une conservation importante. En eﬀet, on ne recense que 500 « core genes » responsables pour le transfert des électrons dans l’ensemble des règnes du vivant (Kim et al., 2013). Des transporteurs d’électrons tels que les quinones ou les cytochromes c participent au transfert des électrons entre les diﬀérents complexes au sein de ces chaînes. Les complexes respiratoires les mieux caractérisés sont les com-plexes mitochondriaux, mais il existe une grande diversité au sein des déshydrogénases, des oxydases et des complexes Rieske/b notamment chez les procaryotes.
Dans un premier temps, les acteurs de la chaîne respiratoire seront présentés de manière « générale », puis au sein de la section sur Geobacil lus stearothermophilus les complexes participant aux super-complexes seront analysés plus en détails.
Les Quinones
Les quinones sont de petites molécules hydrophobes participant à la quasi totalité des chaînes de transfert comme transporteurs liposolubles et mobiles d’électrons et de protons à travers la membrane, en associant la charge positive de deux protons avec la charge né-gative de deux électrons.
Les quinones sont réduites en hydroquinone en début de chaîne par les déshydrogé-nases, telles que la NADH déshydrogénase ou la succinate déshydrogénase puis réoxydées, par exemple par les complexes Rieske/b. Les quinones sont également réduites au niveau du site Qi des complexes Riekse/b (cf. I.1.5). Elles participent au pompage de protons et à l’établissement du potentiel chimiosmotique, en liant deux protons du côté négatif de la membrane et en les relarguant du côté positif (cf. figure I.2).
Une quinone transporte 2 électrons en association avec 2 protons : QH2 ⇋ Q + 2 e− + 2 H+
Cependant, les groupes redox des complexes enzymatiques, comme les hèmes ou les centres Fe-S, ne peuvent généralement accepter qu’un électron à la fois. La quinone a la capacité de séparer sa réaction à deux électrons en deux réactions à un électron, entraînant l’appa-rition d’un intermédiaire réactionnel très réactif, une semiquinone (QH• ou Q•− , appellés SQ dans la suite de cette thèse), pouvant engendrer des ROS. QH2 ⇋ SQ + 1 e− + 1 H+ ⇋ Q + 2 e− + 2 H+
Les quinones impliquées dans les chaînes de transfert bioénergétiques peuvent être classifiées en 2 catégories : les naphthoquinones et les benzoquinones, dont les principales diﬀérences se situent au niveau du potentiel redox.
Les quinones les plus anciennes sont probablement les naphthoquinones ou ménaqui-nones, présentes chez de très nombreuses bactéries et archées. Ces molécules sont consi-dérées comme apparues sous une atmosphère anaérobie et possèdent un potentiel redox de -70 mV. L’augmentation de la concentration d’O2 dans l’atmosphère il y a environ 2,5 milliards d’années, entraîne une augmentation du potentiel redox ambiant dans lequel évoluent les organismes. Les ménaquinones avec leur faible potentiel redox sont oxydées rapidement en présence d’oxygène, de plus l’intermédiaire ménasemiquinone est très in-stable, ce qui pose un problème au niveau du transfert d’électrons au sein des chaînes.
Pour s’adapter à un milieu plus oxydant, les ménaquinones ont été remplacées dans au moins trois régions de l’arbre phylogénétique (cf. figure I.4) : en ubiquinone (chez certaines protéobactéries), en plastoquinone (chez les cyanobactéries), et en caldariellaquinone (chez les Sulfolobales). Ces quinones possèdent un potentiel redox plus élevé, ce qui les rend plus stables en présence d’oxygène.
Une grande partie des organismes utilisant des ménaquinones possède un mécanisme anaérobie, mais chez certaines archées ou bactéries l’utilisation de ménaquinones persiste après le passage à un métabolisme aérobie, comme chez les bactéries du groupe Bacil li, auquel appartient Bacil lus subtilis et Geobacil lus stearothermophilus.
Le pool de quinones peut servir à changer de voie métabolique et joue un rôle cen-tral dans la régulation des CTE, notamment au niveau des chaînes branchées, comme chez de nombreux procaryotes possédant diﬀérentes oxydases terminales. Chez certains organismes comme E. coli, le changement de type de quinone permet le passage d’un mode aérobie avec l’utilisation d’ubiquinones à un mode anaérobie avec l’utilisation de ménaquinones (Ingledew et Poole, 1984).
Les cytochromes c
Les transporteurs d’électrons de type cytochrome c sont de petites protéines (autour de 10-12 kDa), solubles (comme chez la mitochondrie) ou ancrées à la membranes (chez cer-taines bactéries gram positive comme G. stearothermophilus), contenant un ou plusieurs hèmes de type c. Elles sont présentes dans diﬀérents contextes physiologiques (respiration aérobie, ou dénitrification, photosynthèse…) et peuvent avoir plusieurs partenaires méta-boliques, tels que les CcOx, les cytochromes c peroxydase, les sulfite oxydases, les nitrite réductases, etc… Dans les chaînes respiratoires, ils sont réduits au niveaux des complexes Rieske/b puis transportent les électrons jusqu’aux oxydases.
Quand ces protéines sont ancrées à la membrane, elles possèdent un linker flexible qui permet l’interaction avec les diﬀérents partenaires. Par exemple, Paracoccus denitrificans possède un cytochrome c552 structuré en 3 domaines : un domaine N-terminal avec un segment transmembranaire servant à ancrer la protéine à la membrane, un linker très flexible contenant 40 résidus et un domaine globulaire de 100 résidus contenant un hème c lié covalemment par deux résidus cystéine (Rajendran et al., 2010).
Si certains organismes sont dépourvus de cytochrome c, comme Corynebacterium glu-tamicum (Bott et Niebisch, 2003), d’autres en possèdent plusieurs types. C’est le cas de Geobacil lus stearothermophilus et de Rhodobacter spheroides, qui possèdent deux types de cytochrome c. Chez G. stearothermophilus, les deux cytochromes : cyt c550 et cyt c551 interagissent chacun avec une oxydase diﬀérente, respectivement la CcOx caa3 et la CcOx bo3 (Wachenfeldt et Hederstedt, 1990).
NADH:quinone oxydoréductase
Une des bases du métabolisme oxydatif est la conversion du pouvoir réducteur présent dans les composés extraits de la nourriture en NADH (ou NADPH). Ce pouvoir réducteur est ensuite transmis au pool de quinone de la chaîne respiratoire, situé dans la membrane interne des mitochondries ou dans la membrane plasmique des bactéries et des archées.
Dans de nombreuses espèces, cette réaction est catalysée par trois groupes très diﬀérents de NADH déshydrogénases :
– Les NADH déshydrogénases de type NDH-2, aussi appelées NADH déshydrogé-nases « alternatives », qui n’utilisent pas l’énergie redox du couple NADH/NAD+ pour transloquer des protons supplémentaires.
– Les NADH déshydrogénases qui pompent des cations Na+ sont des Nqr. Ce sont des complexes membranaires uniquement présent chez les procaryotes.
– Enfin, les plus étudiées sont les NADH déshydrogénases de type NDH-1, présentes notamment dans certaines mitochondries, et aussi appelés complexes I. Ce sont des protéines membranaires complexes qui participent à l’établissement du gradient électrochimique de protons.
Ces trois familles ont des origines évolutives indépendantes et possèdent des méca-nismes réactionnels diﬀérents (Kerscher et al., 2008), mais catalysent la même réaction d’oxydo-réduction : le transfert d’électrons du NADH à la quinone, NADH + H+ + Q ⇋ NAD+ + QH2

Table des matières

I Introduction
I.1 Processus de transformation d’énergie
I.1.1 Différents mécanismes
I.1.2 Quelques données sur l’évolution de ces processus
I.1.3 Les transferts d’électrons
I.1.4 La théorie chimiosmotique
I.1.5 Les acteurs des chaînes respiratoires aérobies
I.1.6 Les chaînes respiratoires procaryotes
I.2 L’organisation en super-complexes
I.2.1 Deux théories contradictoires
I.2.2 Les super-complexes, pour quoi faire ?
I.3 Le super-complexe de la chaîne respiratoire de G. stearothermophilus
I.3.1 Geobacillus stearothermophilus : une bactérie thermophile
I.3.2 Le super-complexe cytochrome b6c : CcOx caa3
I.3.3 La chaîne respiratoire de G. stearothermophilus
I.4 Objectifs
II Matériel et Méthodes
II.1 Matériel
II.1.1 Souches bactériennes
II.1.2 Produits chimiques
II.1.3 Systèmes de purification et colonnes
II.1.4 Spectrophotomètres
II.2 Méthodes
II.2.1 Production et purification du super-complexe
II.2.2 Analyses biophysiques de l’échantillon
III Résultats
III.1 Production du super-complexe
III.2 Purification
III.2.1 Solubilisation et test de détergents
III.2.2 G. stearothermophilus possède-t-il un super-complexe ?
III.2.3 Mise en place d’un protocole de purification
III.2.4 Vers la cristallographie
III.3 Caractérisation du super-complexe purifié
III.3.1 Composition en sous-unités du super-complexe
III.3.2 Polydispersité de l’échantillon
III.3.3 Spectroscopie visible
III.3.4 Étude du super-complexe par spectroscopie RPE
III.3.5 Fixation du CO sur le super-complexe
III.4 Titration redox des cofacteurs
IV Discussion
IV.1 Diversité des oxydases
IV.2 L’isolement d’un super-complexe respiratoire
IV.2.1 Le(s) super-complexe(s) de G. stearothermophilus
IV.2.2 Le(s) super-complexe(s) purifié(s)
IV.3 Caractérisation de l’hème ci
IV.4 Les transferts d’électrons dans une chaîne respiratoire à ménaquinone
IV.4.1 Un décalage des potentiels redox
IV.4.2 Le Q-cycle et les ménaquinones
IV.5 Perspectives
V Bibliographie
Liste des abréviations
A Annexes
A.1 Obtention de cristaux
A.2 Gels natifs et gels 2D