Transpiration cuticulaire (taux de déperdition d’eau de la dernière feuille : R.W.L.)

C’est une méthode qui permet d’identifier les génotypes de blé adaptés à des conditions défavorables. Elle a été utilisée par Clarke et Mc Caig (1982), Jaradat et Konzak (1983), Clarke et Townely-Smith (1986) et (Clarke et al., 1989). Elle est basée sur la détermination du taux de déperdition d’eau dans des feuilles excisées, appelée pour cette raison par (Clarke et Richards, 1988 in Benchallel, 1994) «La transpiration résiduelle» et par (Mushow et Sinclair, 1989 in Benchallel, 1994). Au stade 5 feuilles, on choisit deux feuilles pour chaque catégorie (P.M.G.) pour tous les traitements des deux variétés de blé dur. Cette méthode aussi consiste à couper les feuilles à la base du limbe. Elles sont collectées dans des sachets en plastique et sont   transportées immédiatement au laboratoire et après on pèse ces feuilles (poids frais initial) et après deux heures, les feuilles sont repesées afin de déterminer le poids frais. Chaque échantillon est ensuite mis à sécher à l’étuve à 80 °C pendant 24 heures. Puis, on le pèse (c’est le poids sec). Les valeurs de la transpiration cuticulaire sont déterminées par la formule suivante : 𝑅. 𝑊. 𝐿. = 𝑃𝑓𝑖 − 𝑃𝑓2𝑕 𝑃𝑠 × 1 𝑆. 𝐹 × 120 𝑚𝑛 R.W.L.: (exprimé par g/cm2 /mn). Pfi : poids frais initial. Pf2h : poids frais après 2 heurs. Ps : poids sec. S.F : Surface Foliaire. Pour la surface foliaire, elle a été déterminée par une méthode traditionnelle qui consiste d’une part, à reproduire la feuille de blé sur papier qui est ensuite pesé et d’autre part, à couper un carré de 1 cm2 de coté du même papier et de peser juste après, on en déduit la surface assimilatrice (Paul et al., 1979). 

Extraction et dosage de la chlorophylle

Le travail a porté sur la détermination de la teneur en chlorophylle de la dernière feuille, de chaque catégorie avec le traitement des deux variétés (V1 et V2) de blé dur. L’extraction de la chlorophylle des tissus foliaires a été réalisée suivant la méthode de (Mc Kinney, (sd) in Arnon, 1949). On prélève 1 g de matière végétale fraiche, pesé juste après son prélèvement (Dans le 1/3 médian des dernières feuilles) avec deux répétitions pour chaque catégorie (P.M.G.) de tous les traitements des deux variétés de blé dur. Le végétal est coupé en petits morceaux et broyé dans un mortier avec 25 ml d’acétone à 80 % et quelques milligrammes de carbonate de calcium (CaCO3) pour faciliter le broyage. – 46 – Après broyage total, L’extrait est filtré à l’aide d’un papier filtre, ensuite mis dans des boites noires pour éviter l’oxydation de la chlorophylle par la lumière. Le dosage se fait par le prélèvement de 3 ml de la solution dans une cuve en verre à spectrophotomètre et la lecture se fait aux deux longueurs d’onde λ = 645 nm et 663 nm, après étalonnage de l’appareil avec la solution témoin d’acétone à 80 %. Les teneurs en chlorophylles (a), (b), (a + b) et (a/b), sont données à partir de ces formules et exprimées en (μg / g de MF) : CHla = 12, 7. Do.663 – 2, 69. Do.645 (Hixot et Israel-Stam, 1978). CHlb = 22, 5. Do.645 – 4, 68. Do.663 (Mc Kinney, (sd) in Arnon, 1949). CHla + CHlb = 8, 02. Do.663 + 20, 20. Do.645 (Brown et White, 1986). Do. : La densité optique (valeurs données par le spectrophotomètre aux longueurs d’ondes (645 et 663 nm). CHla : Chlorophylle a. CHlb : Chlorophylle b.

Tests biochimiques

Extraction et dosage de la proline

La proline est quantifiée selon la technique de Troll et Lindsley (1955) simplifier et mise au point par Dreier (1978) et modifier par Monneveux et Nemmar (1987). Deux prélèvements de 0,1 g de matière végétale fraiche, (prélever au 1/3 médian de la feuille) sont effectués, pour chaque catégorie (P.M.G.) des deux traitements (témoin et stress) des deux variétés de blé dur. Ces échantillons sont placés dans des tubes à essai, auxquels on ajoute 2ml de méthanol à 40 %, on chauffe au bain marie à 85 °C pendant 60 minutes et pour éviter la volatilisation de l’alcool, les tubes sont fermés hermétiquement pendant le chauffage. Après refroidissement, on prélève 1 ml de l’extrait de chaque tube à essai, qu’on met dans un autre jeu de tubes et auquel on ajoute 1 ml d’acide acétique et 1 ml de réactif préparé par un mélange fait de (120 ml d’eau distillée plus 300 ml d’acide acétique plus  80 ml d’acide orthophosphorique (H3PO4) plus 25 mg de ninhydrine). Le tout est porté à ébullition à 100 °C pendant 30 mn, la solution vire au rouge. Après refroidissement, on ajoute 5 ml de toluène par échantillon, qui permet après agitation de distinguer deux phases, une supérieure organique qui contient la proline et l’autre inférieure aqueuse sans proline. Après avoir récupéré la phase supérieure, on ajoute du sulfate de sodium (Na2SO4) à l’aide d’une spatule pour éliminer l’eau qu’elle contient. On procède enfin à la détermination des densités optiques des échantillons à l’aide d’un spectrophotomètre réglé sur une longueur d’onde de 528 nm. Le zéro du spectrophotomètre est réglé grâce au blanc de gamme composé de (1 ml de méthanol à 40 % + 1 ml d’acide acétique + 1 ml du mélange + 25 mg de ninhydrine). La quantification se fait d’après l’équation de la courbe d’étalonnage suivante : 𝑦 = 0,029 𝑥 + 0,053 Avec : (R^ 2 = 0,981). x : quantité de proline exprimée en (μg / g de MF) y : valeur du spectrophotomètre (La densité optique ou l’absorbance).

Extraction et dosage des sucres solubles

Le dosage des sucres solubles a été réalisé selon la méthode de (Schields et Burnett, 1960), elle est aussi dite méthode à l’anthrone en milieu sulfurique. Le principe de cette méthode repose sur la condensation des produits de dégradation des sucres neutre. L’acide sulfurique concentré transforme à chaud les glucides en dérivés sulfuriques : Les hexoses produisent les dérivés qui donnent avec l’anthrone une coloration verte présentant un maximum d’absorption à 585 nm. Deux prélèvements, de 0,1g de feuilles sont pris du tiers médian de la feuille. Sont effectués, pour chaque catégorie (P.M.G.) des deux traitements témoin et stressé des deux variétés de blé dur étudiées. L’extraction des sucres solubles est faite à froid, en mettant le végétal dans des tubes à essai auquel sont ajoutés 3 ml d’alcool (l’éthanol à 80 %) pendant 48 heures. – 48 – La solution en suite passe au bain marie à 70 °C pendant 30 mn une fois l’alcool est disparu, on ajoute 20 ml d’eau distillée dans la totalité de l’extrait. Le réactif de l’anthrone doit être préparé quatre heures à l’avance avec les proportions suivantes : 0,2 g d’anthrone dans 100 ml d’acide sulfurique pur. Dans des tubes à essai propres, on prélève de chaque tube 2 ml de la solution à analyser à la quelle on ajoute 4 ml du réactif à l’anthrone, le tout est maintenu à O °C dans la glace pendant l’opération ; pour éviter l’éclatement des tubes (car la réaction est exothermique). Après agitation par agitateur, les tubes placés dans un bain marie à 90 °C pendant 8 mn. La solution vire alors légèrement au bleu vert pour l’arrêt de cette réaction, les tubes sont refroidis dans un bain glacé et à l’obscurité pendant 30 mn pour éviter l’oxydation des sucres. L’absorbance est alors lue au spectrophotomètre à une longueur d’onde de (585 nm) après étalonnage de l’appareil par le blanc de gamme composé de (2 ml de l’éthanol à 80 % plus 4 ml du réactif à l’anthrone après agitation, le mélange placé dans un bain marie à 90 °C pendant 8 mn). La teneur en sucres solubles de chaque échantillon est déduite selon l’équation de la courbe d’étalonnage établie avant le dosage : 𝑦 = 0,009 𝑥 − 0,018 Avec : (R^2 = 0,997) y : valeur d’absorbance (Do.) x : quantité de sucres (exprimée en μg / g de MF).