Caractérisation tissulaire de l’os
cortical pédiatrique

Préparation des échantillons 

Les échantillons d’os cortical pédiatrique proviennent de chirurgies correctrices effectuées par le Pr Launay dans le service de chirurgie orthopédique de l’hôpital de La Timone (Marseille, France). Tous les patients étaient mobiles avant l’opération et n’ont reçu aucun traitement connu pour affecter le remodelage osseux. Pour cette étude, 29 échantillons de fibula et 7 échantillons de fémur ont été recueillis chez 33 enfants âgés de 1 à 18 ans. Du fait de la rareté et de la taille des échantillons prélevés, tous les échantillons n’ont pas pu être testés sur l’ensemble du protocole détaillé à la Figure I.16 (page 36). La répartition des échantillons pour chaque essai est détaillée sur la Figure II.1. Avant les essais, les échantillons ont été conservés à -80◦C, enveloppés dans une gaze imbibée de PBS (Phosphate Buffer Saline). Les échantillons d’os cortical adulte proviennent de 17 fibulae de donneurs âgés de 50 à 95 ans et servent de référence (Figure II.1). Les échantillons ont été décongelés à température ambiante. Pour la microCT (puis par la suite pour les tests mécaniques : compression et caractérisation ultrasonore), 1 à 2 éprouvettes cubiques d’environ 2x2x2 mm3 ont été découpées dans l’échantillon d’os cortical avec une scie diamantée à vitesse lente (Buehler Isomet 4000, Buehler, Lake Bluff, IL, USA). La découpe a été effectuée de façon à conserver les faces dans les axes de sollicitations principaux : axial, radial et tangentiel (Figure II.2). A la fin de chaque découpe, les dimensions des éprouvettes sont mesurées grâce à un pied à coulisse digital (Absolute Digimatic solaire, Mitutoyo, incertitude élargie U = 0,03 mm) et la masse volumique grâce à une balance de précision (Ohaus Voyager Pro) équipé d’un kit de détermination de la densité. La découpe a été un grand défi du fait de la taille initiale des échantillons d’os récupérés : déchets chirurgicaux de moins de 1 cm selon l’axe longitudinal, et 2 à 3 mm selon l’axe radial (épaisseur de la corticale). Afin de réaliser des éprouvettes cubiques, ayant des faces parallèles 2 à 2, nous avons développé un nouveau support d’échantillon adaptable à la scie diamantée (Figure II.3). Pour le dosage des molécules de pontage par analyse biochimique, il est nécessaire d’avoir environ 1 g d’os cortical. Les chutes des découpes des cubes ont donc été récupérées pour cette analyse. Le protocole de préparation est détaillé dans la partie Matériel et Méthodes de ce chapitre 2.4 (page 44).. Les axes principaux de l’os ont été conservés : radial (1), tangentiel (2) et axial (3). Enfin, pour la microradiographie et l’analyse par FTIRM, les échantillons ont été imprégnés dans une résine MMA et découpés en section de 100 µm (microradiographie) et 2 µm (FTIRM) selon le protocole décrit page 37. Caractérisation tissulaire de l’os cortical pédiatrique 41 Figure II.3 – Schéma du nouveau support d’échantillon pour la découpe. 

Microtomographie

 Les acquisitions tomographiques et microradiographiques ont été réalisées avec l’aide du Dr Yohann Bala et Dr Hélène Follet au sein de l’unité Inserm 1033 à Lyon. Les analyses morphométriques ont été réalisées selon des protocoles de l’unité Inserm de Lyon mis en place par le Dr Yohann Bala. Pour ces essais, nous avons testé (Figure II.1, page 41) : — 14 fibulae de 14 patients enfants. Age moyen : 13 ± 4 ans (6-18 ans) ; — 16 fibulae de 16 patients adultes. Age moyen : 75 ± 13 ans (50-95 ans). Les tests sont effectués sur des os bruts découpés en cubes de 2 mm de côté (Voir protocole général à la Figure I.16, page 36). 

Acquisition des images

 Pour chaque échantillon cubique, les acquisitions des coupes sont réalisées avec un microtomographe (Skyscan 1174, Aartselaar, Belgium) sur des échantillons immergés dans de l’eau distillée dans un tube en plastique de diamètre intérieur de 6 mm et maintenu en place grâce à une gaze. L’axe longitudinal a été aligné à l’axe de rotation du porteéchantillon. Les paramètres d’acquisition sont les suivants : — Taille des voxels : 8,1 µm isotrope — Champ de vue : 1024 x 1024 pixels — Source des rayons X : 50 kV – 800 µA — Temps d’exposition : 4 s — Rotation de 360◦ avec un pas de 0,6◦ — Moyenne de 2 images — Filtre aluminium de 0,5 mm Chaque coupe est une image 2D enregistrée en format TIFF, initialement en 16 bits (2 16 niveau de gris) rapporté à 8 bits (255 niveaux de gris) et dont les niveaux de gris s’échelonnent de 0 (noir) à 255 (blanc). Pour chaque cube, une pile de 210 coupes a été reconstruite avec le logiciel 3D d’analyse d’image Nrecon (NRecon Software, V 1.6.9, Skyscan NV, Kontich, Belgium).

Analyse morphométrique 

De cette pile d’images reconstruites, les volumes d’intérêt ont été sélectionnés en utilisant une méthode semi-automatique (CTAnalyser Software V 1.14.4, Skyscan NV, Kontich, Belgium). Pour chaque échantillon, les frontières extérieures ont été délimitées par l’opérateur, puis interpolées automatiquement sur l’axe longitudinal définissant le volume d’intérêt (VOI). Dans le volume de tissu (TV, en mm3 ), la porosité (volume de vide) a été segmenté sous forme de solide et l’os minéralisé comme un arrière-plan en utilisant le seuillage global. Les variables morphométriques suivantes ont été calculées : — la fraction volumique de pores ou porosité (Po.V/TV, %); — le rapport entre la surface et le volume de pores (Po.S/Po.V, mm−1 ); — le diamètre de pore (Po.Dm, µm), correspondant au diamètre moyen des pores; — la séparation des pores (Po.Sp, µm),correspondant à la séparation moyenne entre les pores ; — le nombre de pores (Po.N, mm−1 ), calculé comme P o.N = 1 P o.Sp+P o.Dm ; — la connectivité (ConnD, mm−3 ), évaluée par la caractéristique d’Euler selon la méthode décrite par Odgaard and Linde [99] et normalisée par le TV ; — le degré d’anisotropie (DA, sans unité), calculé pour évaluer le motif d’alignement des pores à un axe préférentiel, 0 correspondant à l’isotropie totale et une valeur supérieure à 1 décrivant une augmentation de l’anisotropie de la structure; La séparation et le diamètre des pores ont été calculés à l’aide d’un algorithme d’ajustement sphérique (sphere fitting algorithm) [69, 131]. Comme un indice d’hétérogénéité dans la distribution intra-échantillon du diamètre et de la séparation des pores, l’écart type de ces deux paramètres (Po.Dm et Po.Sp) sont reportées comme Po.Dm.SD et Po.Sp.SD, toutes deux exprimés en µm.

Analyse de la densité minérale du tissu osseux

 Deux fantômes de concentration 0,25 et 0,75 gHA/cm3 ont été imagés en même temps que les échantillons. Une relation linéaire entre le niveau de gris et la densité minérale a été déduite de l’analyse des deux fantômes. La densité minérale du tissu ou TMD (en g cm−3 ) et la distribution de cette densité ou TMD.SD (en gcm−3 ) de chaque échantillon a été calculée à partir de son niveau de gris et de la relation linéaire trouvée précédemment. 2.3 Microradiographie Pour ces essais, nous avons testé (Figure II.1, page 41) : — 14 fibulae de 14 patients enfants. Age moyen : 11 ± 5 ans (4-18 ans) ; — 16 fibulae de 16 patients adultes. Age moyen : 75 ± 13 ans (50-95 ans). Les tests sont effectués sur des sections d’os inclus en résine (Voir protocole général à la Figure I.16, page 36). Les échantillons d’os ont été inclus dans une résine de dureté équivalente à celle de l’os, puis coupés en section de 150 µm d’épaisseur en utilisant une scie à fil diamanté (Escil, Chassieu, France). Ces coupes ont été amincies à 100 ± 1 µm d’épaisseur, puis polies grâce à une suspension d’alumine à 1 µm. L’épaisseur des coupes est mesurée avec un comparateur d’épaisseur micrométrique (Compac, Genève, Suisse ; 1µm de précision). La microradiographie a été effectuée grâce à une source de rayons X L9421-02 (Microfocus Hammamatsu X-ray system) et un détecteur digital numérique (Photonic science CCD camera FDI VHR 11 M; Zone active : 36 x 24 mm ; Scintillateur : Gd2O2S :Tb ; Filtre en aluminium de 12 µm), suivant le protocole validé par Montagner et al. [97]. L’aluminium a été choisi comme étalon pour son faible numéro atomique, proche de celui de l’apatite osseuse. L’étalon est constitué de 8 marches dont l’épaisseur varie de 12 à 96 µm par pas de 12 µm (Strems Chemical Ltd, Strasbourg, France). Les valeurs d’absorption de l’étalon d’aluminium sont ajustées pour obtenir une courbe de calibration de type logarithmique reliant les niveaux de gris à la valeur correspondante du DMB de la forme : DMB = a ln(NG) + b équation dans laquelle NG est le niveau de gris correspondant au cœfficient d’absorption du tissu osseux dans l’image microradiographique considérée, a et b sont dans des constantes adimensionnelles. L’étalon et l’échantillon sont microradiographiés avec un temps d’exposition de 7 sec par image et chaque image est une moyenne de 5 images : le temps d’exposition total pour une image est donc de 35 sec. Nous utilisons un fort grossissement, plusieurs zones sont donc nécessaires pour reconstruire l’échantillon complet. Le calcul de la DMB se fait grâce à un programme MatLab développé au sein de l’unité Inserm 1033 à Lyon. Pour chaque échantillon, 20 régions d’intérêts (ROI) ont été choisies pour faire les mesures : 10 dans le