Impact des perturbateurs environnementaux sur un
organisme sentinelle

BIOMARQUEURS 

C‟est dans les années 1980 que la notion de biomarqueurs prend forme. Cette période voit se dérouler les premiers symposiums internationaux sur les réponses aux polluants des animaux marins (Pollutant Responses in Marine Animals, 1981) et les tests écotoxicologiques dans l‟environnement marin (1983) ainsi que divers programmes (Groupement Interface Chimie-Biologie des Ecosystèmes Marins, 1987) (Narbonne, 2000). Après cette phase de développement, les biomarqueurs ont trouvé leur définition (workshop sur les biomarqueurs organisé par la Société de Toxicologie et de Chimie de l‟Environnement (SETAC, 1989) : « Ce sont des variations biochimiques, physiologiques, histologiques ou morphologiques, mesurées chez des organismes exposés à des conditions de stress liées à la présence de substances chimiques dans l’environnement » (Huggett et al., 1992). Ils représentent la réponse biologique initiale des organismes face aux perturbations ou contaminations du milieu récepteur. En conséquence, ils sont en général plus sensibles que les paramètres mesurés à un niveau supérieur d‟organisation biologique tel que l‟organe, l‟individu ou la population (Stegeman et al., 1992). Parmi les effets induits par les activités anthropiques et/ou les paramètres environnementaux observés au niveau des organismes, on retrouve les perturbations endocriniennes, les effets neurotoxiques, génotoxiques, reprotoxiques, immunotoxiques, etc (Fig. 2). Figure 2. Schéma de synthèse des effets écotoxicologiques (Poisson et al., 2011).

Différentes classes de biomarqueurs

On distingue traditionnellement 3 classes de biomarqueurs (NRC 1987 & Who 1993 in Van Der Oost, 2003) : * Les biomarqueurs d’exposition renseignent sur la présence (et éventuellement sur la quantité présente) dans un organisme donné d‟une substance exogène ou de ses métabolites, ou d‟un produit résultant de l‟interaction entre un xénobiotique et une molécule-cible. Généralement, il est possible d‟établir un lien entre le degré d‟exposition externe et le niveau de réponse interne. Un exemple de biomarqueur d‟exposition est l‟induction des monooxygénases hépatiques à cytochrome P450 par une exposition aux PCBs, par exemple chez la caille japonaise Coturnix coturnix japonica (Stouvenakers et al., 1996) ou chez la moule Mytilus galloprovincialis (Livingstone et al., 1997). En outre, la bioaccumulation de certains polluants environnementaux persistants dans les tissus animaux peut également être considérée comme un biomarqueur d‟exposition à ces polluants (Van Der Oost, 2003). * Les biomarqueurs d’effets diagnostiquent un dépassement, pouvant être transitoire, des capacités de régulation de l‟organisme entraînant des conséquences sur la viabilité (cellules, tissu, individu). Parmi les biomarqueurs d‟effet, nous retrouvons les dommages à l‟ADN résultant de l‟effet génotoxique de certains contaminants, la diminution de la stabilité membranaire ou encore l‟induction ou l‟inhibition des enzymes antioxydantes. La modification par les PCBs de l‟ultrastructure hépatique du barbeau Barbus galloprovincialis par suite d‟une contamination par le benzo[a]pyrène (Akcha et al., 2000) sont des exemples de biomarqueurs d‟effet. *Les biomarqueurs de sensibilité montrent la capacité innée ou acquise d‟un organisme à répondre à une exposition à un xénobiotique spécifique. Cette classe inclut les facteurs génétiques et les changements de récepteurs qui altèrent la sensibilité d‟un organisme à cette exposition. Ainsi, Hong et Yang (1997) ont montré que le polymorphisme génétique des cytochromes P450 chez les êtres humains peut être considéré comme un biomarqueur de sensibilité vis-à-vis de l‟induction de cancers par des polluants environnementaux. D‟après Zhou et al. (2008), un organisme bioindicateur doit présenter idéalement les caractéristiques suivantes : – le biomarqueur doit être relié de façon causale à des effets au niveau populationnel ou écologique ; – être capable d‟accumuler les polluants à des niveaux élevés sans que ceux-ci ne conduisent à sa mortalité ; Généralités 16 – avoir une mobilité réduite afin de refléter une contamination localisée du milieu ; – être abondant et présenter une grande distribution pour un échantillonnage répétitif ; – avoir une durée de vie assez longue pour la comparaison des effets et des niveaux de contamination entre les différents stades de développement ; – fournir suffisamment de tissus biologiques pour d‟éventuelles recherches d‟impacts sur des différents niveaux biologiques ; – être faciles à pêcher et à maintenir au laboratoire ; – vivre dans l‟eau ; – occuper une position importante dans la chaîne trophique ; – présenter des relations effet-dose. 2.3. Notion de bioindicateur et d’espèce sentinelle Un bioindicateur est un organisme (ou partie d‟un organisme ou une communauté d‟individus) qui renseigne sur la qualité de l‟environnement (ou partie de l‟environnement) (Li et al., 2010). Lorsque ce dernier est présent au sein de l‟écosystème, il est qualifié d‟espèce sentinelle (surveillance passive). Il peut y être introduit de façon standardisée (surveillance active) par encagement (caging). D‟après Lagadic et al. (1998) et Lagadic et Caquet (1996), un bioindicateur peut aussi être un organisme qui, par sa disparition ou par sa présence et/ou son abondance, renseigne sur l‟état de santé d‟un milieu (dans ce cas appelé aussi : indicateur biologique). Nous pouvons ainsi distinguer des espèces «pollusensibles» (bioindicateurs négatifs) et des espèces «pollurésistantes» ou «pollutolérantes» (bioindicateurs positifs). Des outils tels que les indices biocénotiques reposent sur ce principe et permettent d‟évaluer la structure et la santé d‟un écosystème à un instant donné. Cependant, le recensement des différentes espèces peuplant un écosystème donné présente une tâche lourde avec plusieurs limites : il apporte peu ou aucune information sur la cause réelle de la disparition des espèces (prédation, facteurs abiotiques, etc.), sur les contaminants éventuellement responsables de la mortalité des individus ou sur les mécanismes de toxicité ayant conduit à leur mort. La surveillance biologique de l‟environnement, ou «biomonitoring», a pour objectif d‟intégrer l’ensemble des paramètres de l‟environnement intervenant en conditions naturelles (température, oxygène dissous, interactions polluants-milieu) en utilisant les espèces sentinelles comme outil et de fournir des informations exhautives sur les effets de la Généralités 17 contamination chimique du milieu, car les tests de toxicité réalisés en laboratoire ne prennent pas en compte l‟influence de ces multiples paramètres (Smolders et al., 2004). L’espèce sentinelle se définit comme une espèce constituant un témoin de la pollution environnementale par la mesure de variations biologiques individuelles ou sub-individuelles (contrairement aux bioindicateurs, basés sur la simple présence/absence ou l‟abondance des organismes), engendrées par des niveaux de contamination de l‟organisme sub-létaux (toxicité chronique). Les paramètres biologiques mesurés chez les espèces sentinelles ne sont autre que les biomarqueurs évoqués précédemment (Ramade, 1992; Walker et al., 2001). L‟avantage des espèces sentinelles par apport aux espèces indicatrices (bioindicateurs) est donc qu‟elles constituent une approche prédictive, et qu‟elles sont sensibles à des doses plus faibles de toxiques (Ramade, 1992). Les organismes sentinelles prélevés dans un milieu doivent être représentatifs de ce milieu et remplir plusieurs conditions pour refléter les effets d‟une exposition de faible intensité mais sur une longue période. Une espèce sentinelle doit ainsi être sédentaire sur la zone d‟étude afin que les biomarqueurs étudiés soient directement corrélés avec le niveau de pollution du site. La taille de la population doit être représentative pour éviter que les prélèvements réguliers n‟impactent la structure et la densité de la population. Les organismes sentinelles doivent aussi posséder une aire de dispersion large et déterminée permettant d‟effectuer des comparaisons des résultats entre les sites. Afin d‟étudier les effets chroniques de la contamination chimique du milieu, la longévité de ces organismes doit être suffisamment longue, de l‟ordre de plusieurs années. Ces organismes doivent également présenter une résistance aux polluants afin que les niveaux d‟expression des biomarqueurs soient détectables. Bien que résistantes aux contaminants, les espèces sentinelles doivent présenter une certaine sensibilité face aux contaminants afin de permettre l’établissement de relations dose/effet. Enfin, la biologie de l‟espèce doit être suffisamment connue pour différencier le signal du bruit de fond. 2.4. Evaluation des risques de contamination des milieux aquatiques Les mesures des paramètres physiques, chimiques et bactériologiques de l‟eau renseignent sur la qualité de cette ressource (Li et al., 2010), mais leur caractère ponctuel ne permettra pas de révéler d‟éventuelles perturbations perpétrées en dehors des périodes de mesures. De même, ces techniques ne renseignent pas sur l‟état des organismes aquatiques ni  sur les conséquences écologiques engendrées par les changements survenus dans ces écosystèmes. Dans le cas d‟une pollution métallique, la mesure des concentrations des métaux dans le biotope (eau, sédiment) peut révéler l‟existence d‟une pollution, mais ne met pas en évidence le degré d‟accumulation des métaux par les organismes, ni la toxicité engendrée sur les individus et l‟écosystème (Zhou et al., 2008). En conséquent, ces dernières études écotoxicologiques se sont développées afin de mettre en place des outils permettant une meilleure évaluation de l‟état écologique des milieux (Gillet, 2018). Celles-ci passent notamment par la recherche de bioindicateur ou d‟espèces sentinelles servant de support pour la mesure de marqueurs biologiques (biomarqueurs). Ces derniers reflèteront le degré des atteintes de l‟environnement. 2.5. Avantages et limites de l’utilisation des biomarqueurs Les biomarqueurs sont des outils mis en œuvre pour établir un diagnostic de risque environnemental. Ils constituent un signal précoce de l’effet de la contamination sur les organismes. Leur usage et intérêt dans la détermination du risque environnemental sont devenus incontournables, toutefois le manque de connaissance sur les mécanismes physiologiques et fonctionnels et le comportement de certains organismes aquatiques sentinelles utilisés limitent fortement l‟utilisation optimale de ces outils. L’utilisation des biomarqueurs peut s’avérer très pertinente dans certaines conditions, mais pas dans d’autres, induisant ainsi à un diagnostic erroné. Un biomarqueur unique ne permet pas de rendre compte de l‟ensemble des contaminants présents dans les écosystèmes et susceptible de perturber l‟état de santé des organismes qui y vivent. Afin de prendre en compte la grande diversité des contaminants et la multiplicité de leurs effets, il est apparu nécessaire de recourir à une approche multi-biomarqueurs basée sur la mesure de plusieurs biomarqueurs complémentaires (Blaise et al., 2002 ; Galloway et al., 2004). Les biomarqueurs sont plus particulièrement conçus pour l‟évaluation d‟un risque écotoxicologique et visent à rechercher la signature biologique de l‟impact ou de la présence d‟un contaminant dans une structure vivante. Le biomarqueur parfait et universel n‟existe pas. Un biomarqueur peut s‟avérer très pertinent dans certaines conditions, mais ne pas répondre, voire induire un diagnostic erroné. Ces conditions varient en fonction de plusieurs paramètres qu‟il est inconcevable de présumer de la pertinence d‟un biomarqueur dans toutes les situations possibles, parfaitement claires et définies. Généralités 19 Les mélanges de substances et les contaminations multiples impliquent de potentiels synergies et antagonismes, ce qui complexifie déjà grandement la compréhension des faits. Néanmoins, de nombreux autres facteurs sont susceptibles d‟influencer la physiologie d‟un organisme et donc la réponse d‟un biomarqueur. Parmi eux, il est possible de distinguer notamment des facteurs intrinsèques, tels que l‟âge, le sexe, le statut reproducteur ou les caractéristiques génétiques de l‟espèce sentinelle. Enfin, d‟autres facteurs extrinsèques exercent une influence sur la réponse des biomarqueurs, qu‟il s‟agisse d‟interactions biotiques (compétition intra- ou interspécifique, prédation, parasitisme…) ou encore de facteurs abiotiques, tels que la température ou la salinité (Amiard et al., 1998). Si l‟influence de ces facteurs peut être en partie limitée ou, à défaut, correctement appréhendée en conditions contrôlées, l‟interprétation de la réponse des biomarqueurs devient extrêmement plus délicate en milieu naturel (Amiard et al., 1998). Ainsi, les efforts soutenus de standardisation sont généralement restés vains, tant la définition de la gamme de réponses pouvant être considérée comme « normale » pour un organisme s‟avère difficile, voire impossible à établir (Brown et al., 2004).

Description des marqueurs biologiques 

Glutathion réduit (GSH) Les anti-oxydants non enzymatiques comme le glutathion (GSH), les vitamines A et E, l‟acide ascorbique, le β-carotène, l‟interféron β ou les oses simples ont la capacité de fixer ou de détruire les espèces radicalaires (Cossu et al., 1997a,b). Le L-ϒ-glutamyl-L-cystéinylglycine, plus couramment nommé glutathion, est un thiol non protéique de faible masse moléculaire, présent en abondance dans les cellules eucaryotes (Penninckx, 2000). Comme son nom scientifique le suggère, le glutathion est composé d‟acide glutamique, de cystéine et de glycine. La biosynthèse de ce tripeptide se réalise à l‟aide de deux réactions enzymatiques consécutives, chacune d‟entre elles nécessitant la présence d‟une molécule d‟ATP (Meister, 1994). La première réaction permet de lier le glutamate à la cystéine pour former du ϒ–GluCys. Cette réaction est catalysée par la ϒ-glutamyl-cystéine ligase (ϒ-GCL), enzyme hétérodimérique composée d‟une sous-unité catalytique (GCLc) de 73 kDa et d‟une sousunité de régulation (GCLm) de 27.7 kDa (Seelig et al., 1984; Coffinet et al., 2008; VenturaLima et al., 2009). La deuxième réaction, catalysée par la glutathion synthétase, permet de lier la ϒ–Glu-Cys avec de la Glycine pour former le glutathion réduit. Généralités 20 Il a été montré que le glutathion était lui-même capable de réguler sa biosynthèse, en inhibant ou en stimulant l‟activité de la GCL (Richman & Meister, 1975; Iles & Liu, 2005). Cependant, de nombreux facteurs peuvent limiter sa biosynthèse, comme la concentration en GCL (Griffith, 1999 ; Chen et al., 2005), ainsi que la disponibilité des substrats comme l‟ATP, la Cystéine, le Glutamate, ou encore la Glycine. Le glutathion est retrouvé en abondance dans le cytoplasme des cellules, et particulièrement dans les hépatocytes, dans lesquels il peut être présent sous sa forme oxydée (GSSG) ou réduite (GSH). Selon Meister (1988), la forme réduite, qui représente la forme active, est dominante à 90%. Le glutathion, à l‟état réduit (GSH), intervient en tant que donneur d‟électrons dans les processus de défense antioxydants (Valko et al., 2007). Grâce à son groupement thiol (-SH) présent sur le résidu cystéinyl, le GSH est capable d‟inactiver de manière directe les espèces radicalaires en les neutralisant. Cette «neutralisation» se réalise par un simple transfert d‟électrons selon la réaction suivante (DeLeve & Kaplowitz, 1991; Luperchio et al., 1996): GSH + R → GS + RH De manière plus indirecte, le GSH intervient également comme substrat pour de nombreuses enzymes anti-oxydantes comme les glutathion peroxydases ou les glutathion Stransférases.  Glutathion-S transférase Les glutathion-S transférases (GST) représentent une famille d’enzymes multifonctionnelles essentiellement cytosoliques, impliquées dans des opérations diverses de transport et de biosynthèse intracellulaires (George, 1990). Toutefois, la fonction des GST la plus étudiée, concernant les programmes de suivi environnementaux, demeure leur activité de catalyse des réactions de conjugaison entre des groupements hydrophiles endogènes (glutathion), et des molécules réactives comportant des sites électrophiles, capables de réagir avec des macromolécules comme les acides nucléiques (ARN, ADN). A ce titre, les GST font partie des mécanismes de défense des cellules contre des stress chimiques et sont qualifiées d‟enzymes de phase II parce qu‟elles interviennent généralement à la suite des enzymes de phase I (cytochrome P450) qui oxydent les xénobiotiques les rendant parfois plus actif biologiquement (ex HAPs). Une grande variété de composés chimiques induit les GST, parmi lesquels certains inducteurs des cytochromes P450 tels que les HAPs et les PCBs. Ainsi des études in situ et expérimentales ont montré que les GST pouvaient être induites par différentes classes de Généralités 21 contaminants. Ainsi, Damiens et al. (2004) ont montré que des expositions au malathion et au carbofuran induisaient l‟expression de la GST chez des larves d‟huîtres. De plus, il a été démontré que l‟expression de la GST au niveau de la glande digestive et des branchies d‟un mollusque bivalve est proportionnelle à la concentration en HAPs dans les tissus (Gowland et al., 2002; Rocher et al., 2006). Les GST ont été mises en évidence dans la plupart des êtres vivants tels que les mollusques (Fitzpatrick et al., 1997; Blanchette & Singh, 1999), les crustacés (Keeran & Lee, 1987; Leblanc & Cochrane, 1987) et les poissons (George & Young, 1988; Martínez-Lara et al., 1997; Pérez-López et al., 2000). Bien que nos connaissances sur ces enzymes chez les poissons soient limitées, leur intérêt en tant que biomarqueurs de contamination par les contaminants de type HAP, PCB et pesticides dans les écosystèmes marins et dulçaquicoles a été démontré (Boryslawskyj et al., 1988, Narbonne, 1993).  Malonedialdéhyde (MDA) Le MDA est une expression de la lipoperoxydation (Sunderman, 1985; Pompella et al., 1987). L‟utilisation de ce composé comme biomarqueur de stress oxydatif en général, et en peroxydation lipidique en particulier, est largement répandu. Le MDA est un produit des réactions de peroxydation lipidique qui se forme lors de l’attaque des lipides polyinsaturés (de la famille n-6) par des espèces réactives de l’oxygène générées dans certaines conditions de stress, en particulier avec des contaminants organiques (HAP, PCB, pesticides) et inorganiques (métaux de transition). Les hydroperoxydes ainsi formés se décomposent en intermédiaires radicalaires et en aldéhydes dont un des représentants les plus réactifs est le malonedialdéhyde (MDA). Le MDA est un agent alkylant puissant capable de réagir avec les macromolécules biologiques. Le dosage de ce composé présente donc un intérêt certain chez les animaux soumis à des contaminations multiples (Narbonne et al., 1991, PellerinMassicote, 1994). Confirmé par l‟étude Viarengo et al. (1989) de fortes teneurs en MDA chez les moules Mytilus edilus et M. galloprovincialis après une semaine d‟exposition au cuivre.

PRESENTATION DU MODELE BIOLOGIQUE UTILISE: LES SPONGIAIRES

Adaptés à une grande diversité de niches écologiques, les spongiaires sont retrouvés depuis le littoral marin jusqu‟aux zones abyssales et sont également présents dans les eaux douces (moins de 1% des espèces). Plus de 8553 espèces d‟éponges ont été décrites (Van Soest et al., 2012) possédant une grande diversité de formes et de couleurs (Fig. 3). Les éponges marines peuvent constituer l‟organisme macro-benthique majoritaire et représenter Généralités 22 près de 80% de la biomasse de certains habitats comme au niveau des régions polaires (Bergquist, 2001)