PROTOCOLE DE MISE EN CULTURE DES MYCOBACTERIES

La culture, lorsqu’elle est positive, permet l’isolement des mycobactéries et de ce fait confirme le diagnostic. Elle est pratiquée : o dans le cas d’un examen microscopique positif pour s’assurer que les BAAR vus au microscope sont bien des mycobactéries ; o pour leur identification ; o pour la réalisation des tests de sensibilité aux antituberculeux ; o pour la production de matériel bactérien nécessaire à une extraction de molécule. o lors d’examens microscopiques négatifs sur des expectorations de patients fortement soupçonnés de tuberculose. o lorsque la demande de mise en culture est spécifiquement exprimée par un médecin, pour un prélèvement extra-pulmonaire et pour les selles.

PRINCIPE

La culture consiste à isoler les mycobactéries sur des milieux spécifiques à partir de différents types de prélèvements. En raison de la lenteur de la croissance et des exigences nutritives des mycobactéries, elle doit être faite dans des conditions optimales de croissance et de multiplication.Tous les prélèvements provenant des lésions ouvertes et tous produits biologiques normalement contaminés par des bactéries commensales sont d’abord soumis à une décontamination avant la mise en culture (cf. MYCO ANA MO_009, MYCO ANA MO_010, MYCO ANA MO_011).

MATERIELS

Pipettes de transfert graduées en polypropylène de 3ml stériles à usage unique ; – Microtubes stériles de 2ml à capuchon vissant identifiés (n° prélèvement sur bouchon et corps, date). – Milieu de Löwenstein-Jensen (LJ) : o 2 tubes numérotés et datés par échantillon pour tous les prélèvements, sauf o 4 tubes pour les liquides de ponction ex : LCR, liquide d’ascite…et pour les biopsies; et o 8 tubes pour les prélèvements cutanés. – Milieu de Löwenstein-Jensen additionné de pyruvate de sodium à 0,2% (LJ-PYR) : o 1 tube numéroté et daté par échantillon pour tous les prélèvements, sauf o 2 tubes pour les liquides de ponction ex : LCR, liquide d’ascite…et pour les biopsies; et o 4 tubes pour les prélèvements cutanés. – Etuve EB 37°C et 30°C.

MESURE D’HYGIENE ET SECURITE 

Les manipulations ont lieu dans le laboratoire NSB3, pièce VIROLOGIE 2. – SUIVRE STRICTEMENT LES PROCEDURES « HYGIENE ET SECURITE AU LABORATOIRE NSB3 ». 

PROTOCOLE AU LABORATOIRE NSB3

Ensemencement et incubation – Ranger les tubes sur un portoir : Sous PSM : o Pour les prélèvements décontaminés : à l’aide d’une pipette de transfert stérile, ensemencer 4 gouttes (environ 200 µl) par tube du culot de centrifugation sur deux tubes de LJ et un tube de LJPYR à incuber à 37°C. o Pour les pièces biopsique ou opératoire, le liquide de ponction, ensemencer en plus 4 gouttes par tube de la suspension liquide sans décontamination, sur deux tubes de LJ et un tube de LJPYR, à incuber à 37°C. o Pour les prélèvements cutanés, ensemencer en plus deux autres tubes de LJ avant décontamination et deux autres tubes après décontamination qui seront incubés à 30°C, et deux tubes de LJ et un tube de LJPYR à incuber à 37°C. – Transférer le reste du culot de centrifugation ou du prélèvement liquide dans un microtube stérile identifié qui sera stocké à –20°C. – Décontaminer les tubes avec un papier absorbant imbibé de désinfectant approprié avant de les sortir du PSM. – Changer de gants, répartir l’inoculum sur la surface du milieu et ranger les tubes en position couchée et bouchon dévissé à moitié fermé sur un plateau suivant le numéro et la date d’ensemencement pour faciliter la lecture. – Incuber les tubes dans l’étuve à 37°C et/ou à 30°C. 5-2- Surveillance des cultures – Surveiller régulièrement jusqu’à l’évaporation de liquide (3-6 jours) avant de revisser les tubes. – Examiner les tubes, le 3è ou 4è jour après l’ensemencement, afin de déceler une souillure éventuelle ou la présence de mycobactéries atypiques à croissance rapide. 5-3 – Lecture des tubes de culture – Faire la lecture une fois par semaine jusqu’à la fin du 3è mois (90 jours). Sélectionner au préalable dans la base de données EpiInfo les prélèvements « ED=3+» à J30 et « ED=1+ ou 2+ » à J60 dont la culture est toujours négative. Imprimer la liste et la descendre au laboratoire NSB3. Au laboratoire NSB3 : – Lorsque le liquide d’ensemencement s’est évaporé, revisser les bouchons. – Dévisser et revisser les autres tubes pour les ré-aérer. – Si des colonies sont observées sur les tubes sortir les 3 tubes et les mettre sur un portoir pour validation, noter sur la fiche paillasse les observations suivant le cas (nombre de colonies) avec la date du jour à laquelle la lecture a été faite.