Recherche de l’activité antimicrobienne

. Matériels Les tests ont été réalisés sur 68 souches microbiennes dont 51 appartiennent à la collection du Service de Microbiologie de la Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques René Descartes Paris et 17 proviennent de la collection du Laboratoire de Chimie de Substances Naturelles et Sciences des Aliments (LCSNSA) de l’Université de La Réunion et du Centre Nationale d’ Application des Recherches Pharmaceutiques (CNARP). La liste de ces souches est présentée dans le tableau 14 et le tableau 15.  

Méthodes

Deux méthodes différentes ont été adoptées pour la recherche des activités antimicrobiennes. Il s’agit de : – La technique de dilution en milieu solide, – L’antibiogramme.

La technique de dilution en milieu solide

Cette technique consiste à mettre les échantillons à tester en solution dans du DMSO stérile pour faciliter leur diffusion dans l’agar. Chaque produit testé est solubilisé dans le DMSO pour préparer la solution mère et les dilutions. Dans la boîte de Pétri, le mélange suivant est versé et homogénéisé : 0,25 ml de solution du produit de concentration précise dans le DMSO, 1,75 ml d’eau stérile et 18 ml de gélose de Mueller-Hinton en surfusion (liquéfié à 100 °C puis ramené à environ 50 °C) ; ce qui fait 0,12 % de DMSO dans la boîte (il a été vérifié que cette concentration n’inhibait pas les bactéries). Ainsi des concentrations variant de 0,75 à 200 mg/l en produit dans les milieux Thèse de Doctorat Chimie des Produits Naturels Faliarivony RANDRIAMIALINORO 107 de culture contenus dans la boîte de Pétri sont préparées. Un témoin est préparé pour chaque échantillon de produit, contenant uniquement le solvant, eau ou DMSO, et la gélose. Quand le milieu de culture est solidifié, l’inoculation des suspensions bactériennes, à environ 106 cellules/ml, est réalisée à l’aide d’un inoculateur automatique, permettant de déposer 52 souches. L’incubation dure 24 h à 37 °C. Criblage et CMI Les tests se font généralement sur 3 séries d’analyses pour chaque échantillon de produit naturel à tester. La première série consiste en un criblage sur toutes les espèces bactériennes disponibles provenant de souches de référence (ATCC, CIP, Coll. Paris V). Pour ce criblage, on teste une seule concentration de produit (100 µg/ml). Tenant compte du résultat de la première série de test, la deuxième série consiste à la détermination de la CMI des produits sur les espèces bactériennes sensibles provenant cette fois des souches de référence et de souches cliniques. La troisième série de test consiste à la confirmation de la valeur de la CMI trouvée dans la deuxième série de test. Dans le cas où un résultat est douteux ou superflu, le produit est testé de nouveau. 

Recherche de l’activité antifongique

L’étude de l’activité antifongique est réalisée par la technique décrite par Favel et al. en 1994. Un millilitre de chaque extrait de plante de concentration finale égale à 1 mg/ml est ajouté dans 19 ml de milieu de culture PDA (Potatoes Dextrose Agar) maintenu à 45 °C. Le mélange est ensuite versé dans des boîtes de Pétri. Ces dernières sont mises à sécher pendant 15 min à 37 °C. 10 µl de chaque germe testé à une suspension correspondante à 0,5 Macfarland sont déposés à la surface du milieu. Les boites de Pétri sont incubées à 25 °C pendant 72 h. Sont considérées positives les cultures où il y a une croissance normale visible des moisissures. Les témoins négatifs ont été préparés par spot des souches testées à la surface des milieux sans extraits [Senhaji et al., 2005]. 

L’antibiogramme 

Principe Le test consiste à déposer des disques imprégnés d’une quantité définie d’antibiotique à la surface d’un milieu gélosé préalablement ensemencé avec une suspension de bactéries. L’antibiotique diffuse au sein de la gélose. Les concentrations d’antibiotique diminuent du centre vers la périphérie. Il apparaît une zone circulaire appelée halo d’inhibition ou auréole d’inhibition autour du disque si la souche est sensible à l’antibiotique. Le diamètre de la zone d’inhibition varie en fonction du degré de sensibilité de la bactérie à l’antibiotique [Duval et Soussy, 1991]. 

Mode opératoire

Le test se déroule en 3 étapes successives : 1 ère étape : La colonie jeune de 24 h de chaque souche bactérienne étudiée est mise en suspension dans de l’eau physiologique pour former un inoculum. 2 ème étape : Une quantité d’inoculum égale à 2 ml a été répartie dans des boîtes de Pétri contenant le milieu Mueller Hinton pour les bactéries et Sabouraud pour la levure selon la technique d’inondation. L’excès est ensuite aspiré avec une pipette stérile. Chaque boîte est séchée sous la hotte pendant 15 à 20 min. Les antibiotiques de références ainsi que les disques stériles d’antibiogramme imprégnés de 10 µl d’extrait à tester à une concentration bien déterminée sont déposés à la surface du milieu à l’aide d’une pince fine stérile. Miconazole (50 µg/disque) est l’antifongique de référence. Pour les bactéries, Néomycine (30 µg/disque), Gentamycine (30 µg/disque) et Kanamycine (30 µg/disque) sont utilisées comme antibiotiques de références. Les tests pour chaque souche ont été effectués en triple et la moyenne sera prise comme le résultat final. Les boîtes de Pétri sont incubées à 37 °C pendant 24 h pour les bactéries et 48 h pour la levure. 3 ème étape Le diamètre de l’halo d’inhibition est mesuré avec une règle graduée. La substance a une activité sur le germe quand un halo d’inhibition apparaît autour du disque. Les résultats sont évalués en se référant aux normes de Ponce et al. (2003) données dans le tableau 16.